Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Последовательность подачи реагентов в реакционную смесь, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность анализируемого участка ДНК.

Последовательность реакций пиросеквенирования

 

 

В реакции пиросеквенирования участвуют четыре фермента. Схема и основные этапы реакции представлены на рис. 1. 

Схема реакции пиросеквенирования.jpg 

    Рисунок 1. Схема реакции пиросеквенирования. ИнтерЛабСервис

 

Пиросеквенирование включает в себя следующие этапы:

 

Этап 1

Амплификация фрагмента ДНК и биотинилирование цепи, которая послужит матрицей для пиросеквенирования. Денатурация биотинилированного одноцепочечного ПЦР-ампликона, его изоляция и гибридизация с праймером для секвенирования.

 

Этап 2

Инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5’- фосфосульфата (APS) и люциферина.

 

 

Этап 3

Добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК-полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов.

 

Этап 4

АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’-фосфосульфата. Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу.

 

Этап 5

В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, не встроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид.

 

Этап 6

Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. Следует отметить, что дезоксиаденозин-альфа-тио-фосфат используется в роли заместителя дезоксиаденозин-3-фосфата (дАТФ), так как он эффективно распознается ДНК-полимеразой, но не распознается люциферазой. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме.

 

 

Пиросеквенаторы PyroMark (QIAGEN) ИнтерЛабСервис

 

Объединяя секвенирование и количественную оценку генетических изменений в одной мощной системе, приборы серииPyroMark превосходят все другие системы секвенирования при целевом анализе небольших фрагментов ДНК. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению временных и денежных вложений при использовании PyroMark в разнообразных областях применения.

Подробности на сайте: https://ru-ru.facebook.com/InterLabService